• NSND Ngọc Giàu vai Ngọc Ngà:
  Một nhân vật lớn tuổi nhưng cá tính. Bà đam mê những mẫu đầm hoa trẻ trung, tóc nhuộm màu sáng, khi búi cao, khi tết sợi mảnh cá tính.[4][5] Đây cũng là người phụ nữ lớn tuổi nhất trong gia đình, là mẹ của Ngọc Nữ, bà ngoại của Ngọc Nhi và Ngọc Như.[6] Ngọc Ngà trong phim còn được thể hiện là một người thích chơi bài tứ sắc. Bà cũng thường xuyên hỗ trợ cho những người thân trong gia đình và giúp cho Ngọc Nữ thay đổi tư tưởng.[7]
• Lê Giang vai Ngọc Nữ:
  Ngọc Nữ là chủ một gia đình ba thế hệ toàn phụ nữ. Bà Nữ tháo vát, chăm lo cho mẹ và hai con gái. Bà là đại diện cho người phụ nữ truyền thống, ăn mặc kín cổng cao tường, khó tính và đanh đá.[8] Từng bị phụ bạc nên bà không thích đàn ông nên tính cách bà rất độc đoán.[9][10] Theo tiết lộ của đạo diễn - nhà sản xuất Trấn Thành, vai bà Nữ lấy cảm hứng từ người phụ nữ bán bánh canh cua giá 300.000 đồng gây tranh cãi trên mạng xã hội.[8][11] Bà Ngọc Nữ có hai người con gái là Ngọc Nhi và Ngọc Như.[12] Nữ diễn viên cũng đã chia sẻ và gọi đây là vai diễn hay nhất trong sự nghiệp của mình.[13]
• Khả Như vai Ngọc Như:
  Cô là con gái lớn của Ngọc Nữ. Cô yêu và đã kết hôn với Phú Nhuận. Mặc dù vậy nhưng cô luôn có sở thích là kiểm soát chồng của mình.[12] Ngọc Như có tạo hình sặc sỡ, màu mè, bản tính thích khoe giàu khi đeo vàng và nữ trang đầy người. Không chỉ thế, cô nàng này còn nhuộm tóc tết bím không khác gì "chị đại" khu phố.[14]
• Huỳnh Uyển Ân vai Ngọc Nhi:
  Nhi là một cô gái xinh đẹp với cá tính mạnh mẽ và cũng người người nhỏ nhất trong gia đình.[15] Một cô gái luôn phải sống theo định hướng của mẹ từ khi còn bé.[12] Ngọc Nhi được mô tả có khát khao sống được là chính mình, theo đuổi ước mơ mà mình muốn, đại diện cho thế hệ Z.[16]
• Trấn Thành vai Phú Nhuận:
  Phú Nhuận chồng của Như, "cánh mày râu" duy nhất trong gia đình trong thân phận ở rể, thường xuyên bị réo sai việc vặt như cơm bữa và không được sự tôn trọng bởi các thành viên trong gia đình.[15][16] Tuy nhiên, anh chàng này có thói quen hay bia, rượu.[10]
• Song Luân vai John:
  John là một trong số các chàng trai đang ngỏ ý quen Ngọc Nhi.[10][17]
• Lý Hạo Mạnh Quỳnh vai Quỳnh Lý:
  Một trong hai chàng trai đang ngỏ ý quen Ngọc Nhi.[10][17]

Phim còn có sự góp mặt của NSND Việt Anh (vai ông Liêm), Lê Dương Bảo Lâm (vai Youtuber Lê Minh Hổ),[18] NSƯT Công Ninh (vai ba John), Ngân Quỳnh (vai mẹ John), Phương Lan (vai Lan)... Không giống như bộ phim điện ảnh Bố già, trong dự án Nhà bà Nữ, Trấn Thành chỉ vào vai tuyến nhân vật phụ và tập trung làm đạo diễn.[19][20]